核酸合成儀是現(xiàn)代分子生物學、基因組學及生物醫(yī)藥研發(fā)的核心裝備，它能夠在體外高效、精準地合成特定序列的DNA或RNAoligonucleotide（寡核苷酸）。其技術原理融合了固相合成技術、有機化學與精密自動化控制，實現(xiàn)了對生命遺傳密碼的“按需編寫”。
 

　　一、核心原理：固相磷酸亞胺化學法

　　當前主流的核酸合成技術均基于固相合成原理，其核心是磷酸亞胺化學法。該方法具有高效、高產(chǎn)率且易于自動化的特點，取代了早期的磷酸二酯法和磷酸三酯法。整個合成過程在儀器的合成柱內(nèi)進行，目標鏈的合成方向是從3'端向5'端。

　　合成的一個循環(huán)主要包括四個基本步驟：

　　1.脫保護：

　　合成起始于共價連接在固相載體上的第一個核苷酸。該核苷酸的5'-羥基被保護基團所封閉。循環(huán)的第一步是用酸溶液沖洗合成柱，脫掉第一個核苷酸5'端的DMT保護基，暴露出活性的5'-羥基，為下一步偶聯(lián)反應做好準備。脫下的DMT陽離子呈橙色，可通過光度法在線監(jiān)測合成效率。

　　2.活化與偶聯(lián)：

　　接下來，儀器將下一個要被連接的核苷酸單體和活化劑同時泵入合成柱。核苷酸單體本身是高度活化的，其3'端通過磷酸亞胺基團保護，5'端則由DMT保護，堿基上也有相應的保護基。

　　活化劑會激活核苷酸單體的3'磷酸亞胺基團，使其成為一個良好的親電試劑。隨后，它迅速與固相載體上已暴露的5'-羥基發(fā)生親核取代反應，形成亞磷酸三酯鍵，從而將新的核苷酸加到正在延長的寡核苷酸鏈上。

　　3.蓋帽：

　　偶聯(lián)步驟并非100%有效，總有極少數(shù)鏈的5'-羥基未能參與反應。這些失敗的序列如果不被封閉，將在后續(xù)循環(huán)中繼續(xù)參與反應，產(chǎn)生缺失序列的副產(chǎn)物。

　　“蓋帽”步驟使用兩種試劑的混合液對未反應的5'-羥基進行乙酰化封端，使其permanently失活。這些被“蓋帽”的短鏈在最終純化時會被去除，從而極大提高最終產(chǎn)物的序列正確性和純度。

　　4.氧化：

　　上一步偶聯(lián)形成的是不穩(wěn)定的亞磷酸三酯鍵，容易被酸分解。本步通入碘/水/吡啶的混合溶液，將其氧化成更穩(wěn)定的磷酸三酯鍵，從而完成一個完整的核苷酸添加循環(huán)。

　　此后，儀器自動重復上述“脫保護→偶聯(lián)→蓋帽→氧化”四個步驟，每一個循環(huán)添加一個新的核苷酸，直至整條目標序列全部合成完畢。

　　二、合成后處理

　　核酸合成儀完成鏈的組裝后，所得產(chǎn)物仍是連接在固相載體上且所有基團均被保護的DNA粗品。因此需要后續(xù)處理：

　　1.切割與脫保護：使用濃氨水溶液處理，一方面將合成的寡核苷酸鏈從CPG載體上切割下來，另一方面同步移除所有堿基上的保護基團和鏈末端的DMT基團。

　　2.純化：根據(jù)應用需求，可通過高效液相色譜（HPLC）或聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）等進行純化，以去除失敗序列和副產(chǎn)物，得到高純度的最終產(chǎn)品。

　　三、總結

　　核酸合成儀的本質(zhì)是一臺高度自動化的精密有機化學反應器。它通過將復雜的合成化學反應分解為一系列可編程控制的標準化步驟，并由計算機精確控制液體流速、試劑用量和反應時間，從而實現(xiàn)了DNA/RNAoligonucleotide的快速、高通量和精準合成。這一技術的成熟與普及，極大地推動了基因編輯、PCR檢測、核酸藥物、DNA存儲等前沿科技的飛速發(fā)展。